monoclonale ​antistoffen

Vorig jaar heb ik samen met m'n lab partners monoclonale antistoffen geproduceerd. Wat zijn monoclonale antistoffen en hoe worden deze gekweekt?

Monoclonale antistoffen zijn 1 soort type antistof. Deze worden gemaakt in plasma cellen.

Als eerst word er een antigeen in een muis gespoten. De muis gaat plasma cellen maken. De plasma cellen bevinden zich in de milt. Wanneer de muis de plasma cellen heeft gevormd pakken we daar een aantal cellen van.

Bij cellen is het zo dat ze niet oneindig kunnen delen. Omdat na elke cel deling een klein stukje van de zijkante van het DNA verloren gaan. Dit DNA heeft alleen de functie om het DNA waar de belangrijkste informatie staat te beschermen. Op een gegeven moment is dat DNA op en zal de cel niet meer delen. Anders zou er belangrijke informatie verloren gaan. Hierdoor voegen we kanker cellen toe. Kanker cellen hebben een enzym (telomerase). Dit enzym bindt aan het uitende van het DNA en bij elke celdeling blijft al het DNA intact. Er zal niks verloren gaan. Door PEG toe te voegen vormen deze 2 cellen samen 1 cel (hybridomacellen)

Het kan zijn dat niet alle kanker/plasma cellen gecombineerd zijn. We willen alleen de hybridomacellen. Daarom voeren we de HAT-selectie uit. Hierdoor blijven alleen de hybridomacellen in leven.

De 1e stap is om de cellen op te kweken. Dit wordt gedaan in een T25 flesje. In het flesje zitten de cellen en 5 mL groeimedium (stoffen zoals eiwitten zodat de cellen kunnen vermeerderen).

Vervolgens hebben de hybridomacellen zich kunnen vermeerderen. In het flesje zit 5 mL dit gaan we langzaam opschalen van 10 tot 50 mL in een T75 flesje maar daarbij voegen we minder groeimedium toe. Dit zodat de cellen antistoffen gaan produceren.

Tijdens dit proces gaan we bepalen of de muishybridomacellen monoclonale antistoffen produceert en tot welk Isotype deze behoren. Dit doen we met behulp van een Isostrip van Roche

Afbeelding aan de rechter kan is de uitslag van de Isostrip. De linkse strip is de controle strip. Hierbij zie je een streep bij de + en een kleine streep bij de K. de k staat voor kappa. Hierna deden we ook een test om te kijken welke antistof het is (zie de linkse afbeelding) Hier ook weer een streep bij de + controle en een licht streepje bij de IgG1.

Conclusie: De antistof die we aan het kweken zijn behoren tot antistof IgG type 1 met een kappa keten.

Na het kweken van de antistoffen. Gaan we de antistoffen scheiden van de plasma cellen. Dit hebben we gedaan door de vloeistof via een spuit door een filter te brengen (cellulose-acetaat-filter). De volgende stap is om de antistoffen te concentreren. Dit hebben we gedaan d.m.v. een kunstnier. De vloeistof + antistoffen worden door de dunne vezels van de nier gepompt. De vezels in de nier hebben een Cut-off van 10-15 kD en laten geen eiwitten groter dan 15 kD door. Er wordt druk opgebouwd door middel van de slang aan de bovenkant van de kunstnier gedeeltelijk dicht te klemmen. Door de druk wordt de vloeistof door de vezelsnaar "buitengedrukt". Omdat er een constante flow in de nier aanwezig is worden de eiwitten die in de vezels aanwezig blijven mee rondgepompt en komen via de slang aan de bovenkant van de kunstnier in het beker glas terecht. Uiteindelijk zit er in de buis alleen vloeistof met antistoffen + eiwitten.

Oké wat hebben we nu gedaan. We hebben gekweekt, de cellen gescheiden van de antistoffen en de antistoffen geconcentreerd. In het concentraat zitten nog andere eiwitten die moeten er ook uit maar hoe??

Dit hebben we gedaan met 3 verschillende testen.

test 1: affiniteitschromatografie: Bij affiniteitschromatografie is een molecuul die een bepaalde biologische affiniteit heeft voor een ander biomolecuul aan een kolom gebonden. Hierdoor kan een ander component uit een mengsel worden geïsoleerd. (wij hebben gebruik gemaakt van Proteïne G en A)

Als eerst binden alle eiwitten aan de kolom. Hierna volgen een paar was stappen. Waarbij alleen de antistoffen achter blijven. (In de afbeelding zijn de zwarte driehoekjes de antistoffen en de witte de overige eiwitten) En als laatst wordt er een elutiebuffer toegevoegd. Dit is meestal een zure stof zodat de binding van de antistoffen aan de kolom los komt.

test 2: immunoprecipitatie met magnetische beads.

Hierbij worden metalen bolletjes die gecoat zijn met proteïne G aan de oplossing toe gevoegd. De antistoffen binden daar vervolgens aan. Wanneer je dan een magneetje

langs het buisje houd blijven de metalen beads met de antistoffen hangen. Nu kan de vloeistof weggehaald worden en houd je alleen de beads met antistoffen over.

test 3: SEC colom (Size Exclusion Colom)

Hierbij gaat we scheiden kwa deeltjes grootte. De antistoffen zijn groter dan de kleine eiwitten. Hoe kleiner het eiwit hoe sneller deze gaat. Hier kunnen wij gebruik van maken. We gebruiken hiervoor een kolom met harsbolletjes met daarin een soort doolhofje. De grote eiwitten kunnen daar niet in heirdoor zijn ze sneller beneden. Deze test is minder specifiek dan de voorgaande testen. Hier vinden namelijk geen bindingen plaats.

Na deze testen is de pH verlaagd door de elutiebuffer. Deze moet weer worden verhoogd. De zout concentratie moet worden verlaagd. Hierdoor krijgen de antistoffen weer hun oude vorm. De elutiebuffer had een pH van 3, door deze te vervangen met

PBS wordt de pH waarde 7,4. Door de verlaging van de zoutconcentratie komt de watermantel om het eiwit weer intact. en hierdoor is het eiwit meer stabieler. De dialyse slang bezit een Cut-off waarde van 12-14 KD. Zouten en water kunnen hier wel doorheen en de eiwitten niet

Na de dialyse gaan we onderzoeken welke scheidingmethode (test 1-3) het beste is om te gebruiken. Hiervoor gaan we de zuiverheid bepalen met Elektroforese. Elektroforese is de beweging van elektrisch geladen deeltjes in een elektrisch veld. De grootte en vorm van een moleculen spelen hier een rol bij. Het medium waarin geëlektroforeerd wordt moet elektrisch geleidend zijn. Hiervoor dient de bufferoplossing. Ook zorgt de buffer voor het opvangen van pH veranderingen door chemische reacties. SDS zorgt er voor dat de waterstofbruggen van het eiwit los komen. Het eiwit wordt dan gestrekt en krijgt een negatieve lading dit komt doordat de waterstofbruggen afwezig zijn. Hierna volgt de elektroforese. De

eiwitfragmenten worden aangetrokken naar de positieve kant. De stain-free polycrylamide gels bevatten een unieke "trihalo" component. Door dit component kan je doormiddel van fluorescentie eiwitten detecteren. De trihalo component reageert met het tryptofaan uit de eiwitten

De elektroforese wordt aangezet. in de gel zitten allemaal kleine bolletjes. de kleine eiwitten gaan er gemakkelijk doorheen, de grotere hebben langer de tijd nodig. We voegen ook een ladder toe. Hier zitten eiwitten in met verschillende grote waarvan al bekend is hoe groot deze zijn. Ik kom hier later nog op terug

En dit is dan het resultaat van de elektroforese.

Bij de pool zijn allemaal cijfers te zien. Elk cijfer is voor 1 laantje. In elk laantje hebben we 1 oplossing gepipetteerd. In laan 1 en 18 zijn de ongekleurde ladders. in 9 en 10 zitten de gekleurde ladders. In 2 en 17 zit een + controle van muis IgG. Hierdoor wetten we waar de antistoffen zouden moete zitten. (De antistoffen zijn groter dan 75 kD)

We gaan nu bepalen welke test de beste scheidingsmethode is. Hierbij kan je zien dat laat 5, 7, 12 en 14 het beste zijn op het gebied van antistoffen scheiden. laan 5 en 14 is proteïne G en A (test 1) en Laan 7,12 zijn de magnetic beads (test 2).

Hierdoor zie je dat test 3 (SEC colom) geen goede manier is om antistoffen te scheiden.